Zánětlivé onemocnění plic
Vypracovali: Petra Hug, Linda Anderegg, Alexandra Kehl, Vidhya Jagannathan, Tosso Leeb
Vyšetřovali jsme tři příbuzné dlouhosrsté kolie s opakující se zánětlivou plicní nemocí. Klinické symptomy byly podobné primární celiární dyskinezi (PCD=opakované chronické záněty dýchacích cest). Nicméně psi nenesli žádné známé patogenní PCD varianty. Analýza rodokmenu navrhla recesivní mód dědičnosti. Kombinované propojení a mapování homozygotnosti ve třech případech a sedmi nepostiženými rodinnými členy vymezily 19 kritických intervalů na 10 chromozomech obsahující celkem 99 Mb (jednotka měření v genetice). Genom jednoho postiženého jedince byl sekvenován (sekvence DNA je posloupnost písmen představující strukturu DNA, která má kapacitu nést informaci) a srovnán s kontrolními genomy. Detekovali jsme jen jediný homozygotní variantu měnící protein v kritických intervalech. Detekovaná varianta byla 4bp (bp=komplementární pár) vymazána v genu AKNA kódujícím AT-hook transkripční faktor. To způsobuje posun rámu představující předčasný stop codon(stop codon je trojice nukleotidů, kde se ribozom rozeznává jako počátek genu a končí zde syntéza proteinu) a zkrátí o 37% otevřený čtecí rám. Genotypizovali jsme 88 dlouhosrstých kolií skládající se z rodinných příbuzných a nepříbuzných jedinců. Všechny tři dostupné případy byly homozygotní pro mutantní alelu a všech 85 nepostižených psů byli buď homozygotní divoký typ (67 jedinců) nebo heterozygotní (18 jedinců). AKNA moduluje imunitní odpovědi zánětu. AKNA nakažené myši umírají brzy po narození v důsledku systémových autoimunitních zánětlivých procesů včetně zánětu plic, který je doprovázen zvýšeným průnikem bílých krvinek a destrukcí plicních sklípků. Dokonalé spojení genotyp-fenotyp (genotyp=soubor pokynů kódovaných v DNA, fenotyp=soubor všech pozorovatelných vlastností a znaků živého organismu) a srovnávací funkční údaje silně naznačují, že zjištěná AKNA:c.2717_2720delACAG varianta způsobila u pozorovaných psů závažný zánět dýchacích cest. Naše zjištění umožňují genetické testování, které lze použít k zamezení neúmyslného chovu postižených štěňat.
1. Úvod
Dědičné formy přetrvávající pneumonie nebo zánětlivých onemocnění dýchacích cest jsou u lidí a domestikovaných zvířat často způsobeny primární ciliární dyskinezí (PCD)(=opakované chronické záněty dýchacích cest). PCD je charakterizována ztrátou funkce pohyblivé řasy nejen u plic, ale i u vedlejší nosní dutiny, ve středním uchu, spermiích, v samičím reprodukčním traktu a ependymu mozku (ependym je speciální epitel, který vystýlá dutiny mozkové a centrální kanál mišní). Vadná struktura nebo vada funkce řasinek obvykle vede k opakujícím se zánětům horních a dolních dýchacích cest. Základní patogenezí (rozvoj chorobných změn) je snížena funkce sliznice, působením prachu a infekcí. Je známo, že více než 40 variant genů způsobuje PCD u lidí. Genetické varianty byly také hlášeny u čistokrevných psů. Varianty v CCDC39 a NME5 byly identifikovány v PCD postižených jedincích u bobtailů a aljašských malamutů. Navzdory rozsáhlým znalostem o PCD existují popsané formy dědičných zánětlivých onemocnění dýchacích cest u lidí a psů, jejichž základní genetická příčina je stále neznámá. Změny řasinek také mohou vyplývat z onemocnění dýchacích cest a potom se nazývají sekundární ciliární dyskineze (SCD) (je způsobena zevními vlivy). Rozlišení PCD a SCD na základě klinických příznaků a patologických nálezů může být náročné a není ve veterinární medicíně běžně dostupné.
Majitelé psů si nedávno všimli několika jedinců u dlouhosrstých kolií s recidivující plicní chorobou, která klinicky připomínala psí formy PCD.
2. Materiály a metody
2.1 etické prohlášení
Všechny pokusy na zvířatech byly prováděny v souladu s místními předpisy. Všichni psi v této studii byli v soukromém vlastnictví a byli vyšetřováni se souhlasem jejich majitelů. „Kantonální výbor pro pokusy na zvířatech“ schválil sbírku vzorků krve.
2.2 Výběr zvířat
Tato studie zahrnovala 88 dlouhosrstých kolií. Tři příbuzné dlouhosrsté kolie, dvě z nich jsou napůl sourozenci, měly vracející se plicní chorobu, jak uvedli jejich majitelé. Dalších 85 psů bylo hlášených jako nepostižených podle jejich majitelů. EDTA krevní vzorky byly shromážděny pro izolaci DNA. Také jsme použili 539 vzorků psů jiných plemen, které byly darovány Vetsuisse Biobank. Ti reprezentovali populaci bez příznaků recidivující plicní choroby.
2.3 Extrakce DNA a genotypizace
Genomická DNA byla izolována z EDTA krve pomocí soupravy Maxwell RSC Whole Blood KIt použitím nástrojů Maxwell RSC. Deset dlouhosrstých kolií zahrnující 3 pozitivní případy a 7 kontrolních psů z rozšířené rodiny byli genotypizováni na Illumina canine_HD BeadChips obsahující 220,853 známek.
2.4 Mapování vazeb a homozygotnosti
Pro parametrickou analýzu dat byly použity genotypy 2 nepostižených rodičů, 2 postižených jedinců a 4 nepostižených potomků ze dvou vrhů. Použitím PLINK v 1.09 (PLINK je soubor nástrojů pro analýzu spojení genů) byly odstraněny ukazatele, které nebyly ničím informativní, umístily se na pohlavních chromozomech nebo chyběly u kteréhokoli z devíti psů. Měly také chyby nebo alelickou frekvenci menší než 0,05. Konečný soubor dat obsahoval 65,446 ukazatelů. Analýza parametrů pomocí automazálního recesivního dědičného modelu s plným průnikem nemoci a frekvencí alely 0,4 byla provedena pomocí softwaru Merlin.
Pro mapování homozygotnosti (homozygot=jedinec, jehož genotyp je ve sledovaném znaku tvořen jediným typem alel) byla použita data genotypu (genotyp=soubor pokynů kódovaných v souhrnu gen.informací a uložených v DNA) tří postižených jedinců. K hledání rozšířených oblastí homozigotnosti >1Mb (genotyp je ve sledovaném znaku tvořen jediným typem alel) byl použit PLINK (PLINK=soubor nástrojů pro analýzu spojení genů), který přiblížil skupinu homozygů a samotné homozygy. Výstupní intervaly byly porovnány s intervaly od analýzy vazeb v tabulkách Excelu k nalezení oblastí, které se překrývají. Surové genotypy jednonukleotidové varianty (SNV) (jednonukleotidová varianta=změna v jediném nukleotidu nezávislá na výskytu v populaci) jsou dostupné v S1.
2.5 Celé genomové sekvenování postižené Dlouhosrsté kolie
An Illumina TruSeq PCR-free DNA knihovna s vloženou velikostí 500bp postižené dlouhosrsté kolie byla připravena. Shromáždili jsme 227 milionů 2x150bp párových konců načtených na nástroji NovaSeq 6000(dosah 26,9x). Mapování a seřazení bylo provedeno jak je popsáno. Sekvenční data byla uložena a přiložena u studie PRJEB16012 a vzorky přiloženy k SAMEA4867926 v Evropském nukleotidovém archivu.
2.6 Zvané varianty
Zvaná varianta byla provedena použitím GATK HaplotypeCalle v gVCF módu jak je popsáno. K predikci funkčních efektů zvaných variant byl použit software SnpEff spolu s vydáním anotace 105 NCBI pro referenční sestavu genomu CanFam 3.1. Pro filtrování variant jsme použili 601 kontrolních genomů, které byly veřejně dostupné nebo vyrobené během ostatních projektů naší skupiny.
2.7 Genová analýza
Pro všechny analýzy jsme použili sestavu referenčního genomu psa CanFam 3.1 . Číslování v psím AKNA genu odpovídal NCBI RefSeq se vstupem XM_014117950.2 (mRNA) a XP_013973425.1 (protein).
2.8 Sangerovo sekvenování
Varianta AKNA:c2717_2720delACAG byla genotipizována pomocí Sangerova sekvenování na PCR amplikony (amplikon=malý kousek DNA nebo RNA). 305bp (nebo 301bp pro deleci alely) PCR produkt byl amplifikován z genomické DNA (genomická DNA=DNA tvořící jaderný genom příslušného organismu) použitím AmpliTaqGold360Mastermix spolu se základním 5´-CCT GTG AGC TGG AAT GT-3´ (základ F) a 5´-CTG AGA ATG CCC AGA CCA TC-3´(základ R). Po ošetření exonuklázou (exonukleáza=enzym, který odštěpuje nukleotidy na konci polynukletidových řetězců) I a alkalickou fosfatázou (alkalická fosfatáza=metaloproteinový enzym, který katalyzuje hydrolýzu monoesteru kyseliny fosforečné) byly amplikony sekvenovány na ABI 3730 DNA Analyzéru. Sangerovo sekvenování bylo analyzováno použitím Sequencher 5.1 software.
3. Výsledky
3.1 Popis fenotypu
Majitelé hlásili opakující se pěnivé zvracení, mělké dýchaní, kašel, hlasité zvuky dýchání, výtoky z nosu a horečky u třech příbuzných dlouhosrstých kolií. Bronchopneumonii(=typ povrchového zápalu plic) diagnostikoval soukromý veterinární lékař. Klinické příznaky u dvou psů začaly již ve věku několika dnů. Psi reagovali na léčbu antibiotiky. Nicméně po vysazení antibiotik se stav znovu zhoršil. U dvou postižených psů bylo hlášeno, že žijí po třech letech s častým nažloutlým výtokem z nosu. U třetího postiženého psa nejsou k dispozici žádné informace o průběhu onemocnění.
3.2 Genetická analýza
Byly hlášeny tři související případy. Rodokmen těchto psů je zobrazen v obrázku 1 a naznačoval autosomálně recesivní dědičnost. Pomocí analýzy dvou vrhů se šesti potomky (dva postižení, čtyři nepostižení) a jejich tří rodičů ukázala celkem 18 spojených genomových segmentů v množství 246 Mb. Dále jsme provedli mapování homozygotnosti u tří postižených psů. Sdíleli 87 homozygotních segmentů se stejnými alelami v celkovém objemu 354 Mb. Průnik propojených a homozygotních oblastí vymezil kritické intervaly obsahující 19 segmentů na 10 chromozomech zahrnujících 99 Mb nebo zhruba 4.1% z 2.4 Gb psího genomu. Dvě známé psí PCD kauzativní varianty, CCDC39:c.286>T a NME5:c.43delA nebyly lokalizovány v kritických intervalech a mohly tak být vyloučeny.
Při pokrytí 26.9x jsme sekvenovali genom postiženého psa a nazvali SNV a krátké indely (indel=druh mutace) s ohledem na genomovou sestavu CanFam 3.1. Poté jsme hledali privátní homozygotní varianty v genomové sekvenci postiženého psa, které nebyly přítomny u vzorků 601 psů různých plemen. V kritických intervalech jsme identifikovali jen jednu privátní homozygotní protein měnící variantu.
Varianta představovala deleci 4bp, kterou můžeme označit jako Chr11:68,576,241_68,576,244delCTGT (Shluk CanFam 3.1). Byla lokalizována v AKNA genu kódujícím AT-hook transkripčním faktoru a předpokládá se, že povede k posunu rámců kódující sekvence, XM_014117950.2:c.2717_2720delACAG. Varianta zavádí předčasný stop kodon. Kvůli nedostatku vhodných vzorků RNA jsme experimentálně nezkoumali, zda mutantní trankripty podléhají nesmyslně zprostředkovanému rozpadu nebo nesmyslně alternativnímu spojení. Pokud je exprimován, předpokládaný produkt mutantního transkriptu by postrádal 529 aminokyselin divokého typu proteinu AKNA 1434 aminokyselinami a obsahoval 172 nových aminokyselin na C-konci. Formální označení této varianty je XP_013973425.1:p. Potvrdili jsme přítomnost varianty AKNA:c.2717_2720delACAG v genomické DNA Sangerovým sekvenováním.
Pro tuto variantu jsme genotypizovali celkem 627 psů a hledali nejlepší shodu genotyp-fenotyp. Všechny tři postižené dlouhosrsté kolie přenesly deleci v homozygotním stavu. Osmnáct nepostižených psů byli heterozygotní a předpokládaní nositelé. 67 nepostižených dlouhosrstých kolií bylo homozygotních divokého typu. Jelikož jsme testovali jen malý počet dlouhosrstých kolií zahrnujících mnoho příbuzných vazeb s postiženými psy, nemůžeme spolehlivě odhadnout frekvenci těchto alel v plemeni. Mutantní alela v AKNA:c.2717_2720delACAG variantě nebyla přítomna u 539 dodatečně genotypizovaných psů různých plemen.
4. Diskuze
V této studii jsme identifikovali AKNA:c.2717_2720delACAG jako kandidáta kauzativní varianty zděděné formy vracející se zánětlivé plicní nemoci u psů. Postižení psi byly původně předložení s podezřením na PCD. Byli jsme proto překvapeni, že se u kandidátské varianty ukázalo, že není spojena s ciliální funkcí (cilial=řasinka). Klinický fenotyp zatím ještě nebyl charakterizován do detailu. Předpokládáme opakované zánětlivé plicní onemocnění, aby se zdůraznila fenotypová podobnost postižených psů s Akna -/- mrtvými myšmi.
AKNA kóduje AT-hook transkripční faktor, který má důležitou regulační funkci v imunitním systému. Moduluje transkripci CD40 a ligand (ligand=atom, ion nebo molekula, která poskytuje jeden nebo více elektronových párů centrálnímu atomu) CD154 (také nazýván CD40L) v imunitních buňkách. Ukázalo se, že vzájemné působení CD40 a CD154 se může ukázat v negativní regulaci autoreaktivity T buněk a jejich abnormalita v tomto působení může vést k autoimunitě (=některá složka v imunitním systému reaguje na vlastní systém a tím ho poškozuje). U lidských systémových autoimunitních onemocnění, jako je třeba Vogt-Koyanagi-Haradův syndrom, bylo zjištěna AKNA která byla regulována v CD4+ T-lymfocytech. Dále byla hlášena spojitost mezi variantami genu AKNA s osteoartrózou kolene a zvýšeným rizikem rakoviny děložního čípku díky regulaci v zánětlivé síti. Podle našich znalostí nebyl v žádné vědecké literatuře popsán lidský pacient zasažený opakujícím se zánětlivým plicním onemocněním nebo jinou patologií s variantami zárodečného kódování v AKNA. Data od více než 120 000 lidí v prohlížeči gnomAD naznačují, že varianty funkcí ztráty AKNA (LoF) jsou méně časté, než se očekávalo. Dosud nebyli identifikováni jedinci nesoucí variantu ztrátu funkcí AKNA v homozygotním stavu.
Myši nakažené AKNA -/- jsou menší než jejich sourozenci divokého typu a umírají 10 dní po narození v důsledku zánětu, který je převážně v plicích. Zvýšená infiltrace leukocytů a masivní nadprodukce prozánětlivých cytokinů (cytokin=skupina menších signálních proteinů, které se významně účastní na imunitní odpovědi) a matrixových metaloproteináz (proteiny které vyžadují ke své aktivitě kov) vedou k alveolární destrukci u AKNA -/- nakažených myší. Myší gen AKNA obsahuje 22 exonů a byly zkoumány dva kmeny u nakažených myší. Počáteční kmen byl vytvořen delecí exonů (exon=část sekvence nukleové kyseliny, díky níž se v procesu translace tvoří bílkovina) 19-21. Nebylo hodnoceno, zda by v tomto kmeni mohl být exprimován protein zkrácený na C-konci. Nakažený kmen se podobá situaci v homozygotních mutacích dlouhosrsté kolie, které mají posun čtecího rámce počínaje exonem 13. Později umřela druhá myš díky zkonstruovanému kmenu, kde byla dalece 3 exonu. Exon 3 je největší kódovací exon a kóduje první AT-hookuv motiv AKNA. Oba kmeny nakažených AKNA -/- myší vykazovaly srovnatelné fenotypy.
Genetická vyšetření u psů ukázala perfektní korelaci genotyp-fenotyp varianty AKNA s vracejícím se zánětlivým plicním onemocněním. Tento vztah podporuje příčinou roli AKNA:c.2717_2720delACAG, nicméně neposkytuje definitivní důkaz. Nicméně, známá role AKNA jako důležitého protizánětlivého regulátoru imunitní odpovědi a a výrazných fenotypových podobností postižených psů s nakaženými myšmi AKNA -/- v kombinaci s genetickou asociací silně naznačuje, že AKNA:c.2717_2720delACAG je příčinná varianta.
5. Závěr
AKNA:c.2717_2720delACAG jsme identifikovali jako možnou příčinnou variantu pro dědičné, autosomálně recesivní, vracející se zánětlivé plicní onemocnění u dlouhosrstých kolií. Nález z nakažených myší a těchto psů naznačuje, že AKNA by měla být považována za kandidátní gen pro lidské pacienty s nevysvětlitelným opakujícím se zánětlivým onemocněním plic. Naše zjištění umožnila genetické testování dlouhosrstých kolií, které lze použít k zamezení neúmyslného rozmnožování postižených jedinců a produkci postižených štěňat.
Poděkování
Autoři jsou vděční majitelům psů, kteří darovali vzorky a sdíleli údaje o zdraví a rodokmeny svých psů. Děkujeme Evě Andrist, Nathalii Besuchet Schmutz, Murieli Fragnérovi a Sabrině Schenk za odbornou technickou pomoc, dále Univerzitě v Bernu pro provádění vysoce výkonných sekvenčních experimentů a poskytování vysoce výkonné výpočetní infrastruktury. Dále děkujeme Dog Biomedical Variant Database Consortium pro sdílení dat celého sekvenování genomu od kontrolních psů. Zároveň děkujeme všem psím výzkumníkům, kteří ukládali data sekvencování celého genomu psa do veřejných databází.
Originál této studie je na stránce: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6723478/?fbclid=IwAR1QqnZKaEwXb0ZK_x-7y-4tCyGpQpYn0wAAdXqz0GsbdvrFN02LpGxjC2w
Překlad: Anna Neuvirtová